D. Yu. Rjazantsev, E. M. Ĉudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
La fitopatogena fungo Colletotrichum coccodes kaŭzas danĝerajn malsanojn en terpomoj kaj tomatoj konataj kiel antracnozo kaj tubera nigra makulo. Laŭ morfologiaj trajtoj, ili ofte malfacilas distingi de malsanoj kaŭzitaj de aliaj mikroorganismoj; ĉe verdaj tomataj fruktoj, la malsano povas esti sensimptoma, manifestiĝante nur ĉe maturaj ruĝaj fruktoj. Por rapida kaj preciza diagnozo de la patogeno, realtempa PCR-testosistemo estas ofertita. Por disvolvi testan sistemon, oni determinis la nukleotidan sekvencon de la glicerina trifosfata dehidrogenaza geno de 45 C. coccodes-trostreĉoj izolitaj de terpomaj tuberoj en malsamaj regionoj de Rusio.
Surbaze de la rezultoj akiritaj kaj la analizo de similaj sekvencoj de aliaj specioj haveblaj en la datumbazo GenBank, speci-specifaj enkondukoj kaj enketo por C. coccodes estis dizajnitaj. Por kontroli la specifecon de la kreita testsistemo, PCR estis efektivigita kun DNA izolita de puraj kulturoj de 15 malsamaj specioj de parazitaj kaj saprotrofaj fungoj asociitaj kun tomataj kaj terpomaj plantoj (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). La ĉeesto de Colletotrichum coccodes DNA estis determinita ĉe sojla ciklo de 20-27, dum aliaj specioj estis detektitaj post 40 cikloj aŭ ne estis detektitaj. La testsistemo ebligas fidinde detekti koncentriĝojn de DNA de cokodoj pli ol 0.01 ng / mm3 en la analizita PCR-miksaĵo. Uzante la evoluintan testsistemon, oni esploris la ĉeeston de C. coccodes en tomataj folioj kun simptomoj de fungaj malsanoj kaj en terpomaj tuberoj sen eksteraj simptomoj de la malsano. Folioj kun simptomoj de funga infekto estis kolektitaj de du malsamaj kampoj en la Krasnodara Teritorio, tuberoj - de kampoj en la regionoj Kostroma, Moskvo, Kaluga, Niĵnij Novgorod. Unu tomata folio enhavanta ADN de C. coccodes estis trovita en la Krasnodara Teritorio; signifa ĉeesto de DNA de ĉi tiu patogeno estis detektita en 5 specimenoj de tuberoj kreskigitaj en la regionoj Kostroma, Moskvo, Kaluga.
Enkonduko
Fungoj de la genro Colletotrichum estas danĝeraj fitopatogenoj influantaj cerealojn, legomojn, herbojn, plurjarajn fruktojn kaj berplantojn. Unu el la ĉieaj specioj de ĉi tiu genro, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, estas la kaŭza agento de antracnozo kaj nigra makulo de terpomoj kaj tomatoj, kaj kaŭzas malsanojn de kelkaj aliaj plantoj de la familio de Solanacoj, inkl. fiherboj (Dillard, 1992). C. coccodes influas ĉiujn subterajn partojn de la planto, tigo-bazoj, folioj kaj fruktoj (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). Sur la ŝelo de infektitaj terpomaj tuberoj, oni konstatas la disvolviĝon de grizaj makuloj kun nedistinge prononcitaj randoj, sur kiuj klare videblas nigraj punktoj de sporado kaj mikrosklero. Dum stokado, ulceroj kun moligita enhavo povas formiĝi en la pulpo de tuberoj, t.e. la malsano eniras la antracnozan fazon, kiu tamen estas ege malofta.
Samtempe la simptomoj de antracnozo (haŭtaj ulceroj kun malgrandaj nigraj punktoj) estas tipaj por tomataj fruktoj. Sur la folioj, la simptomoj de C. coccodes aperas kiel malhelbrunaj makuloj, kutime ĉirkaŭitaj de flava histo (Johnson, 1994).
La disvolviĝo de nigra makulo sur la tuberoj difektas ilian aspekton, kiu estas precipe okulfrapa vendante lavitajn ruĝŝelajn terpomojn. Senŝeliga senfoliiĝo kaŭzas troan vaporiĝon kaj pliigitajn stokajn perdojn (Hunger kaj McIntyre, 1979). Damaĝo al aliaj plantaj organoj kaŭzas perdojn, kiuj rimarkiĝis en malferma kaj fermita tero (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Malsanoj kaŭzitaj de C. coccodes oftas en preskaŭ ĉiuj terpomaj regionoj de la mondo, inkluzive de Rusujo (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). La kontrolo de ĉi tiuj malsanoj malfacilas pro la nesufiĉa efikeco de ekzistantaj fungicidoj kontraŭ C. coccodes kaj la manko de imunaj varioj (Read, Hide, 1995).
La inokulo de C. coccodes povas persisti en semtuberoj (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), tomatsemoj (Ben-Daniel et al., 2010), pluvivas longe en grundo, sur plantaj ruboj (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) kaj en fiherboj (Raid, Pennypacker, 1987). La verkoj de kelkaj aŭtoroj (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) montris, ke la disvolviĝo de la malsano en terpomoj kaj tomatoj plejparte dependas de la ĉeesto de inoculum en semo kaj grundo. Tial, por minimumigi la perdojn pro la malsano, necesas diagnozi (inkluzive kvante) la propagulojn de la fungo en la semmaterialo, en la grundo, en la semaj terpomaj tuberoj kaj tomataj semoj metitaj por konservado. Morfologiaj diagnozoj en grundo kaj vegetaĵoj povas esti efektivigitaj nur per la ĉeesto de mikrosklerotoj, kiuj tamen troviĝas ankaŭ en aliaj specoj de fungoj.
La simptomoj sur la tuberoj tre similas al la arĝenta krusto kaŭzita de la fungo Helminthosporium solani. Izolado de Colletotrichum coccodes kaj Helminthosporium solani en puran kulturon estas sufiĉe malfacila kaj daŭras longan tempon pro la malrapida kresko sur nutra medio. Por rapide identigi Colletotrichum coccodes, necesas uzi instrumentajn diagnozajn metodojn. La plej oportuna metodo estas polimeraza ĉena reago (PCR) kaj ĝia modifo - realtempa PCR. Nuntempe testosistemo evoluigita de britaj esploristoj (Cullen et al., 2002) por la ITS1-regiono de rDNA estas uzata en Eŭropo kaj Usono. Ĝia uzo montris bonajn rezultojn en la analizo de rusaj izolitaĵoj (Belov et al, 2018). Tamen, C. coccodes estas tre varia kaj ĝia detekto de unu DNA-sekvenco povas konduki al falsaj negativaj rezultoj. Por pli fidinda diagnozo, necesas analizi plurajn speciospecifajn DNA-sekvencojn, rilate al kiuj ni disvolvis originalan testosistemon, kiu permesas identigi C. coccodes per la sinsekvo de la geno gliceraldehido-3-fosfata dehidrogenazo.
Materialoj kaj metodoj
Por taksi la efikecon kaj specifecon de la kreitaj testsistemoj, ni uzis purajn kulturojn de 15 specioj de fungoj izolitaj de la aŭtoroj el malsanaj specimenoj de tomataj folioj kaj fruktoj, terpomaj tuberoj (Tabelo 1). Por izolado, oni prenis la organojn de plantoj kun simptomoj de funga infekto, ne pli ol unu organo por arbusto.
Tranĉaĵo de tubero kun ŝelo, tranĉaĵo de tomata frukto kaj tuŝita folio estis metitaj sub duokulan mikroskopon, post kiu micelo, sporoj aŭ peco de histo estis transdonitaj al agar-mediumo (herba agar) en Petri-placo per akrigita dissekcanta nadlo. La izolitaj stokis sur agar-oblikvo en provtuboj je 4 ° C.
Specimenoj de tomataj folioj kun simptomoj de fungaj malsanoj, destinitaj al analizo, tuj post kolektado (sur la kampo) estis metitaj en 70% etilalkoholon, en kiu ili estis konservitaj ĝis izolado de DNA. Terpomaj tuberoj estis liveritaj al la laboratorio, senŝeligitaj (2 × 1 cm-peco) de ili, kaj frostigitaj je –20 ° С. Konservita frosta ĝis izolado de DNA.
Puraj kulturoj de fungoj por izolado de DNA kreskis en likva pizmedio. La micelo de la fungo estis forigita de la likva medio, sekigita sur filtropapero, frosta en likva nitrogeno, homogenigita, kovata en CTAB-bufro, purigita per kloroformo, precipita per miksaĵo de izopropanolo kaj 0.5 M-kalia acetato, dufoje lavita kun 2% da alkoholo. La rezulta DNA estis dissolvita en dejonigita akvo kaj stokita je –70 ° С (Kutuzova et al., 20). DNA-koncentriĝo estis mezurita per HS-kvantuma kitaro por duoble-senhelpa DNA sur Qubit 2017 (Qiagen, Germanio). La alkoholigitaj kaj frostaj specimenoj estis trituritaj en likva nitrogeno, tiam DNA-eltiro estis farita kiel priskribite supre (por la micelo de puraj fungaj kulturoj).
Tabelo 1. Origino de la uzitaj fungaj trostreĉoj
Fungo nomo | Planto, organo | Loko de elekto |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | terpomo tubero | Kostroma regiono, terpomaj tuberoj de la unua kampa generacio, kulturvario Ruĝa Scarlett |
Colletotrichum kokodoj 4 | terpomo folio | Rep. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | terpomo tubero | Magadana regiono, pos. Tendo, terpoma tubero |
Cladosporium fulvum | tomata folio | Moskva regiono, grandfrukta tomato |
Alternaria tomatophila | tomata frukto | submetita de la personaro de la laboratorio pri mikologio kaj fitopatologio de Tutrusia Esplorinstituto pri Plantoprotektado |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | tomata frukto | Krasnodara Teritorio, distrikto Krymsky, grado Kremo |
Fusarium oxysporum | tritika radiko | Moskva regiono |
PCR estis efektivigita per DTprime-amplifilo (DNA-Teknologio). Por PCR, originalaj enkondukoj kaj enketo por la specio-specifa regiono de la glicerina trifosfata dehidrogenasa geno estis uzataj: antaŭa enkonduko Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, inversa imprimado Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1. La enkondukoj plifortigas regionon de 213 bp.
La reago prenis 50 ng da totala DNA (dum analizo de folioj kaj tuberoj) kaj 10 ng (dum analizo de DNA de puraj fungaj kulturoj). La reaga miksaĵo (35 μl) estis apartigita per parafina tavolo en du partojn: la pli malalta (20 μl) enhavis 2 μl de 10 × reaga bufro (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM de ĉiu deoksinukleotida trifosfato, 7 pmol de ĉiu enkonduko, kaj 4 pmol de hidrolizebla fluoreska enketo; la supra enhavis 1 μl da 10 × PCR-bufro kaj 1 U de Taq-polimerazo.
Apartigo de la miksaĵo kun parafino permesas konservi la tubojn dum longa tempo al temperaturo de 5 ° C kaj provizi varman starton de PCR post hejtado de ili dum 10 min al temperaturo super 80 ° C. PCR estis farita laŭ la sekva programo: 94.0 ° C - 90 s (1 ciklo); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 cikloj); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 cikloj); 10.0 ° C - stokado.
rezultoj kaj diskuto
La sekvencoj de la glicerina trifosfata dehidrogenaza geno estis determinitaj en 45 trostreĉoj izolitaj de folioj, tigoj, terpomaj tuberoj kaj tomataj fruktoj (Kutuzova, 2018) en malsamaj regionoj de Rusio. La esploritaj sekvencoj de ĉiuj trostreĉoj estis dividitaj en 2 grupojn malsamantajn en du nukleotidoj. La nukleotidaj vicoj de reprezentantoj de ambaŭ grupoj sub la nombroj KY496634 kaj KY496635 estas deponitaj en GenBank.
La enkondukoj coc70gdf, coc280gdr kaj la cocgdz-enketo projektita surbaze estis kontrolitaj per la programo BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) sur ĉiuj sekvencoj de la glicerina trifosfata dehidrogenaza geno de specioj de la genro Colletotrichum kaj aliaj organismoj haveblaj en la datumbazo GenBank.
Neniuj DNA-regionoj de aliaj organismoj tre homologaj al enkondukoj kaj enketo estis trovitaj.
La sentemo de la testsistemo estis kontrolita uzante specimenojn kun malsamaj koncentriĝoj de DNA de C. coccodes, DNA de terpoma folio infektita per antracnozo (kolektita en 2017 en Mari El, vario Ruĝa Scarlett), kaj ŝelo de tuberoj tuŝitaj de nigra punkto (kolektita en Kostroma regiono, vario Ruĝa Scarlett, Tabelo 2). Por konfirmi la ĉeeston de DNA en tuberoj kaj terpomaj folioj, C. coccodes trostreĉoj estis izolitaj de ili en purajn kulturojn.
La rezultoj de la sentemo-analizo de la testo-sistemo montras, ke ĝi povas esti uzata por sukcese diagnozi la ĉeeston de C. coccodes DNA en specimeno kiam ĝia totala enhavo en la PCR-miksaĵo estas pli ol 0.05 ng. Ĉi tio sufiĉe sufiĉas por detekto, ĉar unu sklerotio enhavas averaĝe 0.131 ng, kaj unu sporo enhavas ĉirkaŭ 0.04 ng de DNA (Cullen et al., 2002). La testa sistemo disvolvita de la brita grupo (Cullen et al., 2002) montris similan sentemon (sojla ciklo 34 ĉe 0.05 ng DNA kaj 37 ĉe 0.005 ng).
Analizo de naturaj specimenoj enhavantaj C. coccodes en ĉiuj kazoj ebligis fidinde malkaŝi ĝian ĉeeston en la specimeno (Tabelo 2). La proponita metodo por izolado de DNA validis ankaŭ por la analizo de naturaj plantaj specimenoj.
Tabelo 2. Determino de la sentemo de la proponita testa sistemo por la identigo de Colletotrichum coccodes por realtempa PCR
Kontrolo | DNA-kvanto en specimeno *, ng | Sojla ciklo | C. kokododetekto |
---|---|---|---|
Mikelio Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Tubera ŝelo 1 | 50 | 32 | + |
Tubera ŝelo 2 | 50 | 30 | + |
Tubera ŝelo 3 | 50 | 31.5 | + |
Terpoma folio | 50 | 29.5 | + |
Notu. * En miksaĵo de PCR-produktoj.
La specifeco de la testo-sistemo estis kontrolita sur DNA-specimenoj ĉerpitaj de 15 specioj de fungoj. Ĉiuj aŭtoj de fungoj estis izolitaj de la aŭtoroj el afektaj kaj sanaj fruktoj kaj folioj de tomato, terpomaj tuberoj; unu trostreĉiĝo estis izolita de tritika radiko (Tabelo 1). Inter tiuj izolitaj de la surfaco de la frukto, estas ankaŭ specioj ne patogenaj por tomato (ekzemple Phellinus ferrugineovelutinus).
Studoj montris, ke DNA de C. coccodes estis detektita ĉe sojla ciklo de 20-27, dum aliaj fungaj specioj ne estis detektitaj aŭ donis signalon post ciklo 40, kiu povas esti atribuita al nespecifa bruefiko (Tabelo 3).
Tabelo 3. Kontrolo de la testa sistemo por diversaj specoj de fungoj
Fungo nomo | Sojla ciklo |
Colletotrichum kokodoj 1 | 20.9 |
C. kokodoj 2 | 22.6 |
C. kokodoj 3 | 23 |
C. kokodoj 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Notu. * La kvanto de DNA en ĉiuj specimenoj estis 10 ng.
La evoluinta testo-sistemo estis uzata por identigi C. coccodes en tomataj foliaj specimenoj kun simptomoj de nekrotrofaj patogenoj kaj semaj terpomaj tuberoj sen videblaj simptomoj. Por la studo, ni prenis semajn tuberojn de diversaj specoj kultivitaj en la regionoj Kostroma, Moskvo, Kaluga, Niĵnij Novgorod. La ĉeesto de C. coccodes DNA estis konsiderata signifa en la specimenoj, en kies analizo la sojla ciklo ne superis 35. Ĉi tiu sojla valoro estis elektita surbaze de la fidinda determino de 0.05 ng de DNA de C. coccodes (sojla ciklo 33.5, Tabelo 2) kaj la fakto, ke sojlo-cikloj super 40, nespecifa DNA de iuj aliaj specioj de fungoj estis diagnozita. Kun ĉi tiu aliro, la signifa ĉeesto de DNA de C. coccodes estis detektita en 5 specimenoj de tuberoj kreskigitaj en la regionoj Kostroma, Moskvo, Kaluga kaj en unu tomata folio de la distrikto Yeisk de la regiono Krasnodar (Tabloj 4, 5).
Tabelo 4. Malkaŝo de Colletotrichum coccodes sur terpomaj tuberoj *
Ekzempla numero | Terpoma vario | Kreskanta loko | C. kokododetekto | Sojla ciklo |
---|---|---|---|---|
1 | Ruĝa Skarlato | Kostroma regiono | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Moskva regiono | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Ukukovskij frue | Moskva regiono | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Kaluga regiono | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Fantazio | Kaluga regiono | - | |
15 | Gala | Regiono Niĵnij Novgorod. | - | |
16 | - |
Notu. * La kvanto de DNA en ĉiuj specimenoj estis 50 ng.
Tabelo 5. Detekto de Colletotrichum coccodes sur tomataj folioj *
Ekzempla numero | Kreskanta loko | C. kokododetekto | Sojla ciklo |
---|---|---|---|
1 | Krasnodara Teritorio, Krimea Distrikto | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Krasnodar-regiono, distrikto Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* La kvanto de DNA en ĉiuj specimenoj estis 50 ng.
La testosistemo kreita de ni ne malsuperas tiun disvolvitan de britaj esploristoj (Cullen et al., 2002) pri sentemo kaj specifeco kaj taŭgas por la analizo de plantaj specimenoj. Ĝia apliko por la analizo de semtuberoj ebligis identigi DNA de C. coccodes en tuberoj sen eksteraj signoj de damaĝo kaj sukcese analizi la infekton de folioj.
Ĝis nun neniu analizo de terpomaj tuberoj por la infestiĝo de C. coccodes estis farita en Rusujo. Nia unua studo montris, ke el 16 provitaj semtuberoj kreskigitaj en malsamaj regionoj de Rusa Federacio, 5 enhavas C. coccodes. Ĉi tio montras, ke nigra makulo de terpomaj tuberoj estas ofta terpoma malsano en Rusujo, kaj ĝia rolo redukti la volumon kaj kvaliton de la terpoma rikolto estas subtaksita.
Analizo de tomataj folioj malkaŝis signifan ĉeeston de DNA de C. coccodes en unu folio de la distrikto Yeisk de Krasnodar-Teritorio. Pli frue, dum ekzamenado de tomataj kampoj en suda Rusio per la brita testsistemo (Cullen et al., 2002), folioj enhavantaj C. coccodes estis trovitaj, kaj en iuj kampoj troviĝis alta proporcio de folioj infektitaj kun C. coccodes (Belov et al., 2018). En la Teritorioj Krasnodar kaj Primorsky, la Moskva Regiono, ni trovis tomatajn fruktojn, el kiuj ni sukcesis izoli purajn kulturojn de C. coccodes. Eblas, ke C. coccodes multe pli disvastiĝis ĉe tomato en Rusujo ol oni kredas nuntempe, kaj ĝia malutilo ankaŭ subtaksiĝas.
Tiel ĝis nun amasiĝis sufiĉe da informoj pri la vasta distribuado de C. coccodes sur terpomoj kaj tomatoj.
Por pli bone kompreni la rolon de ĉi tiu fungo en la disvolviĝo de terpomaj kaj tomataj malsanoj, necesas kontroli ĝian disvastiĝon en Rusujo, studi la rolon de grundaj kaj semaj infektoj kaj la rolon de nigra makulo en perdoj dum konservado. La uzo de PCR-diagnozoj povas signife faciligi ĉi tiun laboron, kaj la samtempa uzo de ambaŭ testaj sistemoj signife pliigos la precizecon de la analizo.
Ĉi tiun laboron subtenis la subvencio n-ro 18-76-00009 de la Rusa Scienca Fondaĵo.
La artikolo estis publikigita en la revuo "Mikologio kaj Fitopatologio" (volumo 54, n-ro 1, 2020).