MANĜU. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Lastatempe montriĝis, ke la askomiceta fungo Ilyonectria crassa kapablas infekti terpomajn tuberojn. Ĉi tiu verko estas la unua, kiu analizas la biologiajn karakterizaĵojn kaj reziston al iuj fungicidoj de la I. crassa trostreĉiĝo izolita de terpomoj. La sekvencoj de speciospecifaj regionoj de la "terpoma" trostreĉiĝo koincidis kun tiuj akiritaj pli frue por fungoj izolitaj de la radikoj de narciso, ginsengo, tremolo kaj fago, lilioj kaj tulipfolioj. Ŝajne, multaj sovaĝaj kaj ĝardenaj plantoj povas esti rezervoj de I. crassa. La esplorita trostreĉiĝo infektis tomatajn kaj terpomajn tranĉaĵojn, sed ne infektis la tutan tomatan frukton kaj sendifektan terpoman tuberon. Ĉi tio montras, ke I. crassa estas vundita parazito. Taksado de rezisto al fludioxonil, difenokonazole kaj azoksistrobin sur nutra medio montris altan efikecon de ĉi tiuj drogoj.
La indico EC50 (la koncentriĝo de la fungicido, kiu bremsas duoble la rapidon de radiala kresko de la kolonio rilate al la fungicida kontrolo) estis egala al 2; 0.4 kaj 7.4 mg / l, respektive. La ebleco de la disvolviĝo de la malsano kaŭzita de I. crassa devas esti konsiderata kiam fitopatologia takso de terpomaj tuberoj kaj la disvolviĝo de plantoprotektaj rimedoj.
La disvolviĝo de fitopatogenaj mikroorganismoj kaŭzas altajn perdojn en ĉiuj stadioj de kreskado kaj stokado de terpomoj. Kiam oni planas protektajn rimedojn, kutime oni konsideras konatajn patogenojn, kiel specioj de la genroj Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora, ktp. Tamen en la lastaj jaroj pli kaj pli multaj raportoj aperis pri la apero de novaj fitopatogenaj mikroorganismoj sur terpomoj. Ilia biologio estas malbone studita, la efikeco de fungicidoj uzataj sur terpomoj rilate al ili estas nekonata, diagnozaj metodoj ne estis disvolvitaj. Kun amasa disvolviĝo, ili kapablas kaŭzi gravan damaĝon al la terpoma rikolto. Unu el ĉi tiuj mikroorganismoj estas la askomiceta fungo Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, unue malkovrita de la aŭtoroj pri terpomaj tuberoj (Chudinova et al., 2019).
Ĉi tiu verko prezentas la rezultojn de la analizo de la I. crassa trostreĉiĝo izolita de terpomaj tuberoj. La morfologio de kolonioj kaj micelaj strukturoj de I. crassa, nukleotidaj sinsekvoj de specioj specifaj DNA-regionoj, severeco al terpomoj kaj tomatoj, kaj rezisto al iuj popularaj fungicidoj estis studitaj.
Materialoj kaj metodoj
Ni uzis la I. crassa 18KSuPT2-trostreĉiĝon izolitan en 2018 de la tuŝita terpoma tubero kreskigita en la regiono Kostroma. La tuberon trafis seka putra tipo kun kavo kovrita per helbruna micelo. Uzante sterilan dissekcantan kudrilon, la funga micelo estis transdonita en Petri-pladon kun agarmedio (bierherbo 10%, agar 1.5%, penicilino 1000 U / ml). La platoj estis kovataj en la mallumo je 24 ° C.
Luma mikroskopo Leica DM2500 kun cifereca fotilo ICC50 HD kaj duokula mikroskopo Leica M80 kun cifereca fotilo IC80HD (Leica Microsystems, Germanio) estis uzata por foti, taksi la grandecon kaj morfologion de sporoj kaj spororganoj.
Por izoli DNA, la funga micelo kreskis en likva pizmedio, tiam frostiĝis en likva nitrogeno, homogenigis, kovis en CTAB-bufro, purigis per kloroformo kaj lavis dufoje kun 2% da alkoholo.
La DNA-eltira metodo estas detale priskribita en la artikolo de Kutuzova et al. (2017).
Por determini la speciojn per molekulaj metodoj kaj kompari kun aliaj konataj I. crassa trostreĉoj, PCR estis farita per enkondukoj, kiuj permesis plifortigon de specioj specifaj DNA-regionoj: ITS1-5,8S-ITS2 (enkondukoj ITS5 / ITS4, White et al., 1990), genregionoj b -tubulino (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) kaj traduko plilongiga faktoro 1α (tef1α) (enkondukoj EF1-728F / EF1-986R, Carbone kaj Kohn, 1999). Amplikonoj de la dezirata longo estis eltiritaj el la ĝelo per la Evrogen CleanUp-ilaro. La plifortigitaj regionoj estis vicigitaj per la BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, Usono) sur Applied Biosystems 3730 xl aŭtomata sekvencilo (Applied Biosystems, CA, Usono). La akiritaj nukleotidaj sekvencoj estis uzataj por serĉi kongruon en la datumbazo GenBank de la Usona Nacia Centro por Bioteknologia Informo (NCBI). Filogenetika analizo estis farita per la programo MEGA 6 (Tamura et al., 2013).
Determino de virulenco estis farita sur tutaj verdaj fruktoj de grandfrukta tomato (vario Dubrava) kaj terpomaj tuberoj (vario Gala). Krome, por simuli damaĝon al difektitaj fruktoj kaj tuberoj, ni uzis tranĉaĵojn de la samaj fruktoj kaj tuberoj. Tranĉaĵoj el tuberoj estis metitaj en humidajn ĉambrojn, kiuj estis Petri-ujoj kun malseka filtropapero ĉe la fundo. Glitilo estis metita sur la paperon, sur kiu, siavice, estis metitaj tranĉaĵoj de tuberoj aŭ fruktoj. Tutaj tuberoj kaj fruktoj ankaŭ estis metitaj en ujojn kun malseka filtropapero ĉe la fundo. En la centro de la tranĉaĵo (aŭ sur la sendifekta surfaco de la tubero aŭ frukto), peco da agaragaro (5 × 5 mm) kun fungaj hifoj estis metita post 5 tagoj de kreskado sur herboragaro.
La takso de la rezisto de fungaj trostreĉoj al fungicidoj estis farita en laboratoriaj kondiĉoj sur agar-nutra medio. Ni studis la malsaniĝemon al fungicidaj drogoj Maxim, KS (aktiva ingredienco fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoksistrobino 250 g / l), Scor, EC (difenokonazole 250 g / l) (Ŝtata katalogo ..., 2020). Taksado estis farita en Petri-pladoj sur herbo-agar-medio kun aldono de la studitaj drogoj ĉe koncentriĝoj de la aktiva substanco 0.1; unu; 1 ppm (mg / L) (por fludioxonil kaj difenokonazole), 10; dek; 1 ppm (por azoksistrobino) kaj en amaskomunikiloj sen fungicido (kontrolo). La fungicido estis aldonita al la fandita medio malvarmetigita ĝis 10 ° C, post kio la medio estis verŝita en Petri-pladojn. Agarbloko kun funga micelo estis metita en la centron de Petri-placo kaj kulturita en temperaturo de 100 ° C en la mallumo. Post 60 tagoj de kovado, la diametroj de la kolonioj estis mezuritaj laŭ du reciproke perpendikularaj direktoj; oni mezumis la mezurrezultojn por ĉiu kolonio. La eksperimentoj estis triobligitaj. Surbaze de la rezultoj de la analizoj, la EC24 estis kalkulita, egala al la koncentriĝo de la fungicido, kiu duonigis la rapidon de radiala kresko de la kolonio rilate al la fungicida kontrolo.
rezultoj kaj diskuto
Sur Petri-ujoj kun herba agaro, la fungo formis koloniojn kun blanka flokula micelo. La mediumo sub la micelo fariĝis ruĝbruna. Kiam la mediumo sekiĝas, la fungo formis du specojn de sporoj sur unuopaj kaj agregitaj konidioforoj en malgrandaj sporodokioj. Makrokonidioj estas longformaj, cilindraj, kun unu ĝis tri septoj, averaĝe longaj 27.2 µm kun gamo de valoroj de 23.2 ĝis 32.2 µm, larĝaj - ĝis 4.9 µm (Fig. 1). La averaĝa longo de mikrokonidioj estas 14.3 µm kun gamo de valoroj de 10.3 ĝis 18.1 µm, la larĝo estas ĝis 4.0 µm. Ĉiuj makro- kaj mikromorfologiaj signoj kongruas en la gamo de variado de la specio Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
La sekvencoj de specioj-specifaj DNA-regionoj (ITS, b-tubulin, TEF 1α) tute koincidis kun la sekvencoj de la I. crassa-trostreĉoj, kiujn ni studis pli frue (Chudinova et al., 2019, Tabelo 1). Por studi la tropezon de I. crassa en aliaj regionoj kaj analizi la spektron de tuŝitaj kulturoj, similaj DNA-sekvencoj en la datumbazo GenBank estis analizitaj (Tablo 1). La interkovro estis 86 ĝis 100%. La sekvencoj de ĉiuj tri DNA-regionoj de la "terpoma" I. crassa trostreĉiĝo estis identaj al la sekvencoj de la trostreĉoj izolitaj de la lilia bulbo kaj narcisaj radikoj en Nederlando kaj de la ginsengradiko en Kanado. Ni ne sukcesis trovi aliajn I. crassa trostreĉojn kun tri analizitaj similaj sekvencoj en malfermaj datumbazoj. Tamen analizo de la deponitaj ITS kaj b-tubulinaj sekvencoj montris la ĉeeston de I. crassa sur tulipaj folioj en Britio. Fungoj kun simila ITS-sekvenco estis identigitaj en la analizo de la mikobioto de tremolaj radikoj en Kanado kaj fagaj radikoj en Italio, terpomaj tuberoj en Saud-Arabio (Tabelo 1). La rezultoj de ĉi tiu studo montras, ke I. crassa havas tutmondan distribuon kaj kapablas infekti diversajn plantospeciojn.
Kiam oni determinis la patogenecon sur tranĉaĵoj de tomato kaj terpomo en la 5a tago, la diametro de la lezo atingis 1.5 cm. La esplorita trostreĉiĝo ne infektis la tutan tomatan frukton kaj sendifektan terpoman tuberon. Tamen la sepaloj estis trafitaj sur la tomato. Por ekskludi la eblon de poluado, funga izolitaĵo el la micelo evoluigita sur terpoma tubero-tranĉaĵo estis izolita en puran kulturon. Ĝi estis tute identa al la gepatra streĉo. Ŝajne, I. crassa estas vundita parazito.
Antaŭplanta kuracado de semtuberoj per fungicidoj reduktas la disvolviĝon de malsanoj sur plantoj dum la kresksezono. Por la elekto de efikaj fungicidoj, gravas taksi, kiuj el ili efikas kontraŭ I. сrassa. La verko studis la disvastigitajn aktivajn substancojn de fungicidoj - fludioxonil, azoxystrobin, difenoconazole. Fludioxonil estas inkluzivita en pluraj miksaĵoj uzataj por pansi semojn kaj semtuberojn antaŭ ol planti. Fludioxonil (Maxim) ankaŭ kutimas trakti semtuberojn antaŭ stokado. Difenokonazolo kaj azoksistrobino ankaŭ estas inkluzivitaj en kelkaj preparoj uzataj por prilabori semmaterialon, kaj ankaŭ en preparoj destinitaj al prilaborado de vegetaj plantoj (Ŝtata katalogo ..., 2020).
La kreskorapideco de I. crassa estis studita sur rimedoj (Fig. 2) kun malsamaj koncentriĝoj de aktivaj substancoj: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoksistrobino (EC50 = 4 ppm), kaj difenokonazole (EC50 = 7.4 ppm) (Tabelo 2). Ĉi tiuj preparoj povas esti konsiderataj tre efikaj kontraŭ I. crassa, ĉar ilia EC50 estas signife pli malalta ol la rekomendinda koncentriĝo de la preparo en la labora fluido uzata por trakti tuberojn. Laŭ la Ŝtata Katalogo ... (2020), la koncentriĝo de fludioxonil en la likvaĵo por trakti terpomajn tuberojn estas de 500 ĝis 1000 ppm, azoksistrobino (en la likvaĵo por trakti la fundon de la sulko) - 3750-9375 ppm, difenoconazole (en la likvaĵo por trakti vegetativajn plantojn) - 187.5– 625 ppm.
Tabelo 1. Sekvenca simileco de speciospecifaj sekvencoj de trostreĉiĝo 18KSuPT2 kaj trostreĉoj de Ilyonectria crassa havebla en la datumbazo Genbank
Trostreĉiĝo | Gastiganta planto, loko de ekskrecio | Sinsekvonombroj deponitaj ĉe GenBank, procento de similecoj | ligilo | ||
ĜIA | β-tubulin | TEF 1α | |||
17KSPT1 kaj 18KSuPT2 | Terpoma tubero, regiono Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, ĉi tiu verko |
CBS 158/31 | Narcisaj radikoj, Nederlando | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al., 2012 |
CBS 139/30 | Lilio-bulbo, Nederlando | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Ginseng-radiko, Kanado | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Tulipfolio, UK | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Dentono, Dentono, 2014 |
MT294410 | Tremolaj radikoj, Kanado | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield et al., 2020 |
ER1937 | Fago, Italujo | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Rekta submetiĝo |
KAUF19 | Terpoma tubero, Sauda Arabujo | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = ne deponita
Tabelo 2. Rezisto de Ilyonectria crassa al fungicidoj
(aktiva substanco) | EC50, ppm | ||||
3-tago | 5-tago | 7-tago | |||
Kontroloj | 17 ± 2 | 33 ± 5 | 47 ± 3 | ||
Quadris, KS (fsoksistrobin) | 18 ± 1 | 34 ± 2 | 48 ± 2 | ||
11 ± 1 | 11 ± 1 | 12 ± 1 | |||
11 ± 1 | 11 ± 1 | 12 ± 1 | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 ± 1 | 28 ± 2 | 48 ± 2 | ||
7 ± 1 | 13 ± 3 | 19 ± 4 | |||
5 ± 1 | 12 ± 1 | 17 ± 5 | |||
Skor, EC (difenokonazole) | 18 ± 1 | 35 ± 2 | 48 ± 1 | ||
11 ± 1 | 24 ± 3 | 35 ± 4 | |||
11 ± 1 | 13 ± 1 | 17 ± 3 |
En nia laboro, I. crassa trostreĉoj estis izolitaj de terpomaj tuberoj en la regionoj Kostroma kaj Moskvo (Chudinova et al., 2019). Alta proporcio de fungaj trostreĉoj kun ITS-sekvencoj identaj al I. crassa estis rivelita dum analizado de la mikobioto de terpomaj tuberoj en Saud-Arabio (Gashgari kaj Gherbawy, 2013). Ŝajne, I. crassa ne estas tiel malofta ĉe terpomoj, kiel ĝi povus ŝajni. Niaj eksperimentoj montris, ke la fungo povus infekti difektitajn tomatajn fruktojn. Laŭ la literaturo, I. crassa kapablas disvolviĝi en la grundo saprotrofe (Moll et al., 2016), kaj ankaŭ influi diversajn plantojn, eĉ taksonomie malproksimajn kiel narcisoj, lilioj, ginsengo, tremolo kaj fago (Tabelo 1). unu). Ŝajne, multaj sovaĝaj kaj ĝardenaj plantoj povas esti rezervoj de I. crassa. Ĉi-supre montras, ke kiam disvolvas protektajn rimedojn, necesas konsideri la eblon tuŝi terpomajn tuberojn kun ĉi tiu fungo. Ĝeneralaj preparoj por la kuracado de terpomaj tuberoj enhavantaj fludioxonil, azoksistrobin kaj difenokonazole montris altan fungicidan efikecon kontraŭ I. crassa.
Ĉi tiun laboron subtenis la Rusa Fondaĵo por Baza Esplorado (Stipendio n-ro 20-016-00139).
La artikolo estis publikigita en la revuo "Plant Protection Bulletin", 2020, 103 (3)